毛細(xì)管色譜柱是目前氣相色譜中用到zui多的色譜柱,可以說是氣相色譜分離的核心, 分析時,選擇*的毛細(xì)管色譜柱可能是一件非常困難的任務(wù)。雖然沒有色譜柱選擇的簡易技巧、捷徑、竅門或秘訣,但卻有些指南和概念來簡化此過程。
一根色譜柱的規(guī)格描述包括其固定相的種類和內(nèi)外部尺寸(柱內(nèi)徑、長度和膜厚等)。不同規(guī)格的色譜柱,對樣品的分離結(jié)果影響也不盡相同,如樣品分離的洗脫順序、保留時間、分離度和峰形/峰高等。另外,在實(shí)際分析應(yīng)用中,色譜柱的性能指標(biāo),如惰性、塔板數(shù)和柱流失率等,同樣會嚴(yán)重影響到樣品的分離效果。
1. 固定相的選擇原則和方法
理論上講,選擇固定相遵循相似性原則,即:用非極性固定相分析非極性物質(zhì),用極性固定相分析極性物質(zhì),用含芳香基團(tuán)的固定相分析芳香族化合物。在填充柱時代,這個想法是非常正確的,因?yàn)槟莻€時候,分離度是首先需要把握的關(guān)鍵因素,分不開,就沒辦法想其它。它的理由在于塔板理論的推論,即:組分在固定相中有越大的溶解度差異,就會產(chǎn)生越大的分離度。
但是在毛細(xì)管色譜時代,分離度不再始終是分析的問題。毛細(xì)管具有幾十萬塊塔板,如此大的柱效率,以至于不再需要充分考慮分離問題了。這個時候,樣品兼容性、使用溫度、穩(wěn)定性、柱流失情況等,都可能成為選擇的主要理由。
例如分析甲醇乙醇丙醇等低級醇類,正常應(yīng)選擇wax類高極性色譜柱。但是在雜質(zhì)較少的情況下,選擇DB-1這樣的非極性柱具有更高的靈活性和使用壽命。具體選擇要依據(jù)以下規(guī)則:
非極性毛細(xì)管柱具有明顯的穩(wěn)定性、高使用溫度、良好的色譜峰形等有利因素,因此易分離物質(zhì)應(yīng)首先選用極性小的色譜柱;分析氫鍵型物質(zhì)用氫鍵型PEG柱更佳;輕烴或*氣體用PLOT柱更佳;高苯基固定相對芳香族物質(zhì)保留能力更強(qiáng);分析二甲苯等芳烴異構(gòu)體,Wax類強(qiáng)極性色譜柱。
在過去的幾十年中,所有的GC應(yīng)用中,非極性色譜柱的使用率高于中等極性柱和極性柱。一般來說,非極性柱,如HP-5MS柱,可應(yīng)用與于50%以上的分析。而極性或中等極性柱,如PEG柱,大概適用于25%的分析應(yīng)用中。通常,我們會先選擇非極性色譜柱,而極性色譜柱會選擇性的用于比較簡單的樣品(較少種類化合物組成的樣品)。
在選擇適用的固定相時,分析設(shè)備和分析條件也是需要參考的指標(biāo)。如檢測器的種類、載氣和進(jìn)樣體積等。
如果我們不考慮對樣品選擇性和檢測靈敏度的影響,那么就使用檢測器低響應(yīng)固定相的色譜柱。比如說含氰基的固定相,像1301、1701、624等這樣的色譜柱就盡量不要與NPD(氮磷檢測器)連用。對于超低流失的固定相,如-1MS或-5MS的柱子,因?yàn)樗鼈兛梢员WCzui低的檢測基線和噪聲水平,所以在做低或超低檢測限樣品時,超低流失色譜柱是的選擇。如果我們使用的載氣不純,或是設(shè)備中有氣體泄漏,這樣的問題無法解決或無法及時解決,為了不使柱固定相過早的被破壞,高溫適用固定相的色譜柱是相對好的選擇。
另外,除非方法需要,我們盡量選擇鍵合固定相的色譜柱,對比非鍵合相和非交聯(lián)相色譜柱,交聯(lián)鍵合固定相色譜柱對樣品種類和進(jìn)樣體積的耐受力更強(qiáng),柱性能下降的zui慢。
在做應(yīng)用方法確證時,我們可同時使用非極性柱和極性柱,對色譜峰鑒定或分離結(jié)果進(jìn)行確證。通常我們做農(nóng)藥分析方法確證時,選用-5MS和 -1701/-35色譜柱;做殘留溶劑分析方法確證時,選用-5MS和-624/-VMS色譜柱;做醇類或FAME分析方法確證時,選用PEG和含氰基固定相色譜柱;做汽油中氧化物分析方法確證時,選用-1和PEG色譜柱。
2. 色譜柱長度
色譜柱的長短直接影響到保留時間和分離效率。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的色譜柱長多為5m、7.5m、10m、12.5m、15m、25m、30m、50m、60m、75m、100m和105m等。zui常見的色譜柱長度是30m。
對于快速分析來說,除了選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)徑,柱長度也短許多(例如5~15mx 0.25mm)。只有這樣,才有可能在zui短的時間內(nèi),得到*的分離效果和分析結(jié)果。
如果方法需要改進(jìn)提高分辨率,較長的色譜柱,如60m或100m,是理想的選擇。分辨率與柱長的平方根成正比。需要注意的是,像一根60m長的色譜柱相對于30m的柱子,其分辨率提高近40%,但分析時間會成倍增長。
在揮發(fā)物的分析應(yīng)用中,為了改善分離效果,常使用較長的柱型,如50m、60m和100m等。在氣態(tài)樣品和精細(xì)烴分析應(yīng)用中,較長色譜柱的使用較為普遍。
更長的色譜柱會影響柱惰性、柱流失和柱效等多個方面。同時,需要更高的載氣壓力或更換載氣的種類(如把氮?dú)飧鼡Q成氫氣/氦氣)。
3. 色譜柱內(nèi)徑的選擇
標(biāo)準(zhǔn)色譜柱內(nèi)徑(ID)尺寸為0.2mm、0.25mm、0.32mm和0.53mm。少數(shù)方法會使用到0.1mm和0.8mm內(nèi)徑的柱子。0.25mm是zui常用的色譜柱內(nèi)徑尺寸,而0.53mm的色譜柱通常是替代填充柱用于大體積進(jìn)樣的方法應(yīng)用。
色譜柱內(nèi)徑的大小對分離效果的影響是明顯的。越細(xì)的色譜柱,其塔板數(shù)就越高,柱效就越高,但同時樣品承載容量越小,進(jìn)樣體積就需要減少。但內(nèi)徑越小,通常意味著柱容量的減小,在分析低含量組分時,對檢測器靈敏度和進(jìn)樣口分流能力的要求越高。因此在選擇內(nèi)徑的時候,首先考慮的是樣品分析難點(diǎn),是在于分離還是檢測。對于分離困難的樣品,較小口徑的色譜柱;對于含量過低檢測困難的樣品,較大口徑的色譜柱。在容易分離的情況下,一般選擇小口徑毛細(xì)管柱可以縮短柱長,減小分析時間。
4. 色譜柱膜厚
商品化色譜柱的膜厚規(guī)格一般是0.1μm、 0.15μm、 0.25μm、 0.5μm、 1.0μm、 1.5μm、 3μm、5μm等等。實(shí)驗(yàn)室中zui常見的色譜柱膜厚為0.25μm、0.5μm和1μm。
膜厚主要影響兩個指標(biāo):保留時間和樣品負(fù)載能力。
另外,色譜柱適用溫度范圍、分析時間和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性等也與膜厚有關(guān)。例如一根內(nèi)徑為0.25mm,膜厚為0.1μm的色譜柱可以達(dá)成快速分離的效果,甚至可以改進(jìn)分辨率,降低色譜柱的流失,適用于更寬泛的溫度范圍等。膜厚會影響到色譜柱惰性,而這個指標(biāo)在有些應(yīng)用中是非常重要的。同時膜厚對色譜柱樣品承載能力的影響也是很明顯的。
0.25μm× 0.25mm、0.5μm × 0.32mm、1μm或1.5μm × 0.53mm規(guī)格的色譜柱在分離效果、保留性能、分辨率、惰性和柱流失等指標(biāo)方面較為均衡,使用也較多。
膜厚與柱內(nèi)徑的關(guān)系體現(xiàn)在相比(β)上。相比β是色譜柱中氣相容積和固定相容積之比,計算公式為β=r/2d,其中r為色譜柱半徑,d為液膜厚度。相比是決定一個固定長度色譜柱中組分流出時間的決定性因素。如果有兩根相同相比和固定相的色譜柱,內(nèi)徑不同,在相同的溫度條件下,兩根色譜柱的分離效果和保留性能相同或相似。
需要注意的是:相比只是決定保留時間的主要因素,但并不是決定理論塔板數(shù)(柱效率)的主要因素。決定柱容量(zui小檢出量)的主要因素是內(nèi)徑和膜厚,決定柱效率的是內(nèi)徑,決定保留時間的是相比。在綜合平衡柱容量、柱效率、分析時間三方面因素的時候,需要注意相比的影響。
zui后要強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是,選擇色譜柱是必須要看具體的分析任務(wù)。如果是做法規(guī)分析,則必須按有關(guān)法規(guī)的要求選擇色譜柱。如一些產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn),盡管用毛細(xì)管柱可以得到更好的分析結(jié)果,且分離效率高、分析速度快,但若國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定用填充柱,那就應(yīng)該用填充柱,否則分析結(jié)果不被法規(guī)所認(rèn)可。當(dāng)然,作為方法開發(fā)的研究,用毛細(xì)管柱常常是有利的。
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